Главная > Химия > Практикум по биологической химии
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

ЖИРЫ (НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЖИРЫ)

Общие понятия.

Жиры — сложные эфиры глицерина и высокомолекулярных жирных кислот.

В состав жиров входят многочисленные предельные (или насыщенные) и непредельные (или ненасыщенные) жирные кислоты. Среди предельных кислот чаще встречаются стеариновая (С17Н35СООН) и пальмитиновая (С15Н31СООН). Из непредельных жирных кислот основная роль принадлежит олеиновой (С17Н33СООН), линолевой (С17Н31СООН) и линоленовой (С17Н29СООН), большое физиологическое значение имеет также арахидоновая (С19Н31СООН) кислота. Непредельные жирные кислоты характеризуются наличием двойных связей: в молекуле олеиновой кислоты содержится одна двойная связь, в молекуле линолевой — две, линоленовой — три, арахидоновой — четыре. Благодаря наличию двойных связей непредельные кислоты отличаются высокой реакционной способностью. Линолевая, линоленовая и арахидоновая (так называемые иолиненасьиценные) кислоты не синтезируются в организме человека и должны поступать с пищей. Недостаток этих кислот в пище вызывает серьезные нарушения обмена веществ, исчезающие при потреблении продуктов, в состав которых входят непредельные жирные кислоты. Поэтому указанные соединения относят к веществам, обладающим витаминным действием (витамин F). Линолевая и линоленовая кислоты содержатся в растительных маслах (льняном, подсолнечном и др.), арахидоновая кислота — в печеночных жирах рыб, сливочном масле и некоторых видах маргарина.

В состав масел некоторых тропических растений входят также циклические жирные кислоты (хаульмугро-вая, гиднокарповая и др.).

Качественные реакции на жиры.

Образование масляного пятна. Каплю масла наносят стеклянной палочкой на кусочек бумаги. Образуется пятно, не исчезающее при нагревании.

Растворимость жиров. Реактивы: а) растительное масло (подсолнечное, льняное, хлопковое или другое); б) твердый жир (бараний, говяжий); в) диэти-ловый эфир; г) ацетон; д) этиловый спирт; е) дистиллированная вода.

Ставят два ряда пробирок по 4 в каждом. В пробирки первого ряда вносят по нескольку капель растительного масла, в пробирки второго ряда— по кусочку твердого жира. В первую пробирку каждого ряда наливают 2 мл дистиллированной воды, во вторую — столько же диэтилового эфира, в третью — ацетона, четвертую — спирта. Все пробирки взбалтывают и наблюдают растворимость жиров в различных растворителях. Пробирки со спиртом рекомендуется подогреть на водяной бане. Записывают результаты опыта.

Эмульгирование жирных масел. Реактив растительное масло; б) углекислый натрий, 2%-ный раствор; в) мыло, 2%-ный раствор; г) желчь; д) дистиллированная вода.

В четыре пробирки вносят по 5 капель масла. В первую пробирку добавляют 2 мл дистиллированной воды, во вторую — 2 мл 2%-ного раствора углекислого натрия (соды), в третью — столько же 2%-ного раствора мыла, в четвертую — воды и несколько капель желчи. Все пробирки взбалтывают и наблюдают образование в первой пробирке неустойчивой эмульсии масла в воде, быстро расслаивающейся при стоянии, а в остальных — устойчивой эмульсии благодаря действию добавленных эмульгаторов, которые адсорбируются в наружном слое жировых капель и понижают их поверхностное натяжение.

Акролеиновая реакция. С помощью пробы на акролеин определяют наличие глицерина в жирах. При нагревании жира с кислым сернокислым калием натрием или борной кислотой происходит отщепление от молекулы глицерина двух молекул воды и образование акрилового альдегида, или акролеина, обладающего резким раздражающим запахом (пригоревшего сала):

Глицерин Акролеин

Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) воск пчелиный; в) кислый сернокислый калий или натрий, кристаллический; г) борная кислота, кристаллическая.

В сухую пробирку вносят несколько капель растительного масла или кусочек животного жира, добавляют немного порошка кислого сернокислого калия (или натрия) или борной кислоты и осторожно подогревают. Появляются белые пары акролеина, обладающие резким запахом. Повторяют реакцию с воском — акролеин не образуется, так как глицерин не входит в состав восков.

Омыление жира. При взаимодействии жиров со щелочами происходит их гидролиз с образованием солей высших жирных кислот (мыла) и глицерина. Натриевые соли представляют собой твердые мыла, калийные — жидкие. Реакция идет по уравнению

Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) кали едкое, 30%-ный спиртовой раствор; в) дистиллированная вода.

В широкую пробирку вносят 0,5 мл растительного масла или около 0,5 г животного жира и добавляют 10 мл спиртового раствора едкого кали. Пробирку закрывают пробкой с воздушным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин., после чего в пробирку наливают горячую воду и растворяют в ней мыло.

Выделение свободных жирных кислот. Реактивы: а) раствор мыла (см. предыдущую работу); б) соляная кислота (1:1 по объему).

К 5 мл раствора мыла добавляют 1-2 мл раствора соляной кислоты. При взаимодействии сильной кислоты с мылом выделяются свободные жирные кислоты, которые всплывают на поверхность жидкости. Реакция идет по следующему уравнению:

Образование нерастворимых мыл. Кальциевые и магниевые соли жирных кислот нерастворимы в воде.

Реактивы: а) раствор мыла (см. работу «Омыление жира»); б) хлористый кальций, 5-10%-ный раствор.

К 2-3 мл раствора калийного мыла добавляют 1 мл раствора хлористого кальция. Выпадает нерастворимый в воде осадок стеарата кальция

Проба на непредельные жирные кислоты. Непредельные жирные кислоты способны присоединять галоиды по месту двойных связей:

Реактивы: а) растительное масло; б) бромная вода (хранят под тягой!); в) диэтиловый эфир или хлороформ.

В пробирку наливают 1-2 мл масла, растворяют его в 2-3 мл диэтилового эфира или хлороформа, прибавляют 1—2 капли бромной воды и взбалтывают. Буроватожелтая окраска бромной воды исчезает, что указывает на присутствие непредельных кислот.

Количественное определение жира. В основу многочисленных методов определения содержания жира в биологическом материале положена способность липидов растворяться в органических растворителях (диэтиловом и петролейном эфире, четыреххлористом

углероде, дихлорэтане, хлороформе и др.). При экстрагировании органическими растворителями в раствор переходят не только жиры, но также свободные жирные кислоты, фосфолипиды, стерины, воска, эфирные масла, пигменты (например, хлорофилл) и ряд других веществ, поэтому продукт, получаемый в результате анализа, называют «сырым жиром» или «суммой липидов». Для практических целей этот показатель обычно является достаточным, в случае же необходимости более точного определения «истинного жира» приходится в отдельных пробах материала исследовать содержание фосфолипидов (по фосфору), эфирных масел (перегонкой с водяным паром), свободных жирнкх кислот (тит-риметрическим методом) и т. д. и вносить соответствующие поправки в результаты анализа.

Приводим метод определения «сырого жира» в семенах масличных культур (по С. В. Рушковскому), нашедший широкое применение в лабораторной практике.

Реактивы и материалы; а) диэтиловый эфир. Для экстракции жира употребляют безводный эфир. В склянку с продажным эфиром прибавляют прокаленный хлористый кальций или негашеную известь (окись кальция). Сосуд укупоривают корковой пробкой, в которую вставляют трубку с прокаленным хлористым кальцием. По истечении 1—2 суток эфир сливают и к нему прибавляют новую порцию негашеной извести или хлористого кальция. Через 6-8 ч эфир сливают в сосуд, на дно которого кладут кусочки металлического натрия. Эфир должен быть также свободным от перекисей. Для этого к 1 л эфира добавляют раствора марганцовокислого калия и 10 мл 40%-ного раствора едкого кали или едкого натра, смесь осторожно взбалтывают и ставят в темное место на 20—24 ч, после чего разделяют в делительной воронке. Нижний слой, водный, отделяют, а верхний, эфирный, несколько раз промывают дистиллированной водой и затем обезвоживают, как описано выше. Внимание! Диэтиловый эфир легко воспламеняется, его пары образуют с воздухом взрывоопасные смеси, поэтому все работы надо проводить при строжайшем соблюдении противопожарных мероприятий. Целесообразно заменять диэтиловый эфир невоспламеняющимся растворителем, например четыреххлористым углеродом или хлороформом;

б) фосфорнокислый натрий двузамещенный, безводный, или сернокислый натрий, безводный. Кристаллическую соль высушивают в течение 6-8 ч при 100—105° С. Сернокислый натрий прокаливают в муфельной печи в течение семена льна, конопли, подсолнуха, рапса, кунжута.

Рис. 11. Экстракционный аппарат Сокслета.

Аппаратура: а) экстракционный аппарат Сокслета (рис. 11). Состоит из трех частей, пришлифованных друг к другу: холодильника шарикового или спирального 1, экстрактора 2 и приемной колбы 3.

Берут 2—3 навески семян но 2—5 г (в зависимости от предполагаемого содержания масла). Навеску переносят в сухую фарфоровую ступку и растирают с безводным сернокислым натрием или фосфорнокислым натрием двузамещенным до получения однородной порошковидной массы. Соли берут в три раза больше по отношению к навеске.

Тщательно растертую массу количественно переносят в пакетик из фильтровальной бумаги, высушенной до постоянного веса. Пакетик заворачивают, как порошок в аптеке, взвешивают на аналитических весах и переносят в экстрактор аппарата Сокслета.

Примечание. В экстрактор можно поместить 4-6 пакетиков.

В приемную колбу наливают эфир (или другой растворитель) на емкости, после чего ее соединяют с экстрактором. В экстрактор наливают столько эфира, чтобы его уровень покрывал пакетики и почти доходил до верхней части сифона, затем с помощью шлифа соединяют его с холодильником и аппарат ставят на холодную водяную баню. Материал настаивают в растворителе

не менее 3-4 ч и лишь после этого включают источник нагрева.

Примечание. Аппараты Сокслета следует установить в вытяжном шкафу. Еще раз подчеркиваем необходимость тщательного соблюдения всех противопожарных мероприятий. Во время заливки эфира выключают все электроприборы в лаборатории.

Пары эфира из приемной колбы по широкой трубке поступают в холодильник, где они конденсируются, и капли растворителя стекают в экстрактор, извлекая жир из растертых семян. Как только уровень эфира достигнет верхнего края сифонной трубки, он тотчас же начнет переливаться в приемную колбу. Таким образом, процесс экстракции продолжается непрерывно. Диэтиловый эфир кипит при температуре 34—35° С, поэтому надо так отрегулировать нагрев, чтобы в течение часа происходило не более 8—10 сливаний растворителя через сифонную трубку.

Экстракцию жира продолжают 5-6 ч (не считая времени настаивания), после чего пакетики с обезжиренным материалом вынимают из экстрактора, подсушивают на стекле в вытяжном шкафу (до испарения эфира) и высушивают (во взвешенных бюксах) при 100—105° С до постоянного веса. Содержание масла в семенах (в процентах на сухое вещество) рассчитывают, зная вес пакетика до и после экстракции, а также вес пустого пакетика. Берут среднее из 3—4 определений.

Определение химических показателей жиров.

По своему составу природные жиры весьма неоднородны. Они состоят из смеси триглицеридов различных предельных и непредельных жирных кислот. Кроме того, в их состав входят также моно- и диглицериды, свободные жирные кислоты, пигменты, жирорастворимые витамины, некоторая примесь белковых веществ. Нейтральным жирам обычно сопутствуют липоиды (фосфатиды, стерины, стериды и т. д.).

Растительные жиры (называемые обычно маслами) характеризуются жидкой консистенцией. В их состав входят главным образом непредельные кислоты. Масло какао и кокосовое — твердые.

Жиры животного происхождения — преимущественно твердые, так как состоят в основном из глицеридов предельных жирных кислот. Животные жиры жидкой консистенции

содержатся в тканях рыб и морских млекопитающих, копытах и костях наземных животных.

Жиры характеризуются рядом химических показателей. Основные из них: кислотное число, число омыления, эфирное число, йодное число.

Примечание. Для более подробной характеристики химических свойств жнров определяют также содержание летучих кислот (растворимых и нерастворимых в воде), окснкислот (ацетильное число), родановое и гексабромное числа и некоторые другие показатели, рассмотрение которых не входит в задачи нашего практикума.

При хранении жира под влиянием кислорода воздуха, влаги и солнечного света, при участии органических катализаторов-ферментов происходит его порча, прогоркание. Растительные масла, богатые непредельными кислотами, прогоркают быстрее, чем твердые жиры. Степень устойчивости жиров при хранении характеризуют перекисное число и содержание альдегидов. В значительной мере об этом свидетельствует и кислотное число, так как при порче происходит гидролитический распад триглицеридов и высвобождение свободных жирных кислот.

Кислотное число. Кислотным числом называется количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.

Реактивы: а) едкое кали, 0,1 н спиртовой раствор;

б) смесь этилового спирта с диэтиловым эфиром (1:1);

в) фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор; г) тимол-фталеин, 1%-ный спиртовой раствор.

В сухую коническую колбу (емкостью 250 мл) отвешивают 3—5 г жира. Навеску растворяют в 50 мл предварительно нейтрализованной смеси спирта с эфиром.

Примечание. Смесь спирта с эфиром нейтрализуют 0,1 н спиртовым раствором едкого калн (в присутствии 3—4 капель раствора фенолфталеина) до слаборозового окрашивания и лишь после этого вливают в колбу с навеской жнра.

Раствор жира титруют 0,1 н спиртовым раствором едкого кали (индикатор — фенолфталеин) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 0,5-1 мин.

При определении кислотного числа темноокрашенных жиров вместо фенолфталеина пользуются 1%-ным спиртовым

раствором тимолфталеина (в кислой среде — бесцветен, в щелочной — голубое окрашивание).

Кислотное число к. ч. вычисляют по формуле

где в — количество 0,1 н спиртового раствора едкого кали, израсходованное на титрование навески жира, мл; к — поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора КОН; 5,611 — титр точно 0,1 н раствора КОН; н — навеска жира, г.

Для характеристики кислотности растительных масел, кроме кислотного числа, часто рассчитывают процентное содержание свободной олеиновой кислоты О по формуле

где к. ч. — кислотное число масла, мг.

Число омыления. Число омыления показывает, сколько миллиграммов едкого кали надо израсходовать для нейтрализации как свободных, так и связанных (в эфиры) кислот, содержащихся в 1 г жира.

Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) едкое кали, 0,5 н спиртовой раствор: 29—30 г гранулированного едкого кали растворяют в 25-30 мл воды, после чего для осаждения карбонатов прибавляют несколько миллилитров 35-40%-ного раствора хлористого бария и раствор в литровой мерной колбе доводят этиловым спиртом — ректификатом до метки. Хранят в хорошо укупоренной склянке оранжевого стекла. Для защиты от проникновения углекислоты воздуха склянку снабжают хлоркальциевой трубкой с натронной известью; в) соляная кислота, 0,5 н раствор; г) фенолфталеин, спиртовой раствор.

Коническую колбу (емкостью 250 мл) взвешивают на аналитических весах, затем в нее вносят около 2 г растительного масла или животного жира и снова взвешивают. По разности устанавливают навеску жира. В колбу с помощью пипетки с резиновой грушей вливают 25 мл 0,5 н спиртового раствора КОН, укупоривают пробкой с обратным холодильником и нагревают на водяной бане 35—40 мин., время от времени взбалтывая содержимое колбы. При омылении жира не следует допускать бурного

кипения воды в бане, которое может явиться причиной вспенивания жидкости в колбе и попадания ее на пробку. К концу процесса омыления раствор в колбе становится однородным, прозрачным, без капелек жира.

Горячий мыльный раствор в колбе оттитровывают 0,5 н соляной кислотой (индикатор — фенолфталеин) до обесцвечивания розовой окраски. Параллельно проводят контрольный опыт с тем же количеством 0,5 н спиртового раствора КОН, но без добавления жира. Контрольный опыт необходим для проверки титра раствора КОН, так как вследствие частичного проникновения углекислоты воздуха и окисления этилового спирта титр может меняться.

Число омыления о. рассчитывают по формуле

где с — количество 0,5 н раствора соляной кислоты, израсходованное на титрование контрольного («слепого») опыта, мл; — количество 0,5 н раствора соляной кислоты, израсходованное на титрование испытуемого образца, к — поправочный коэффициент к титру приблизительно 0,5 н спиртового раствора КОН; 28,055 — титр точного 0,5 н раствора КОН (1 мл раствора содержит 28,055 мг КОН); н — навеска жира, г.

Эфирное число. Эфирным числом называют количество миллиграммов едкого кали, которое требуется для нейтрализации жирных кислот, связанных в виде эфиров в 1 г жира.

Эфирное число э. ч. определяют расчетным путем, вычитая кислотное число из числа омыления:

Таким образом, число омыления является суммой кислотного и эфирного чисел.

Определение количества глицерина в жире.

Химическое определение содержания глицерина в жирах является довольно трудоемким и продолжительным. Сравнительно неплохие результаты дает расчетный метод. Зная эфирное число жира, можно вычислить содержание глицерина, приняв во внимание, что для высвобождения одной молекулы глицерина надо израсходовать три молекулы едкого кали

Процентное содержание глицерина в жире г рассчитывают по формуле

где 92,06 — молекулярный вес глицерина; э. ч. — эфирное число жира; 56,11 — молекулярный вес едкого кали.

Иодное число.

Общие сведения. Иодное число показывает количество граммов иода, которое присоединяется к 100 г жира. Оно свидетельствует о количественном содержании непредельных кислот в жире, что позволяет судить о его устойчивости к окислению, полимеризации и другим превращениям. Йодное число является показателем, характерным для каждого вида свежего жира.

Химизм процесса присоединения галоидов описан выше (см. «Проба на непредельные жирные кислоты»). Следует подчеркнуть, что иод присоединяется главным образом к двойным связям, тогда как более реакционноспособные галоиды — хлор и бром — могут также замещать атомы водорода в углеводородном радикале кислоты.

Наиболее точным является определение йодного числа то Гюблю, однако оно связано с применением весьма ядовитого реактива — сулемы и поэтому не может быть рекомендовано для студенческого практикума. Описываем более простой и быстрый метод определения йодного числа, применение которого не связано с использованием сулемы. Метод обладает вполне удовлетворительной точностью.

Определение йодного числа с бромистым иодом (по Ганусу). Бромистый иод образуется при взаимодействии иода с бромом в уксуснокислой среде.

Бромистый иод количественно присоединяется к непредельным жирным кислотам по месту двойных связей.

Избыток бромистого иола, не вошедший в реакцию, реагирует с иодистым калием по уравнению

Выделившийся иод оттитровывают тиосульфатом

Реактивы: а) растительное масло; б) реактив Гануса: 13 г кристаллического иода растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты (в мерной колбе емкостью . К раствору добавляют 8,2 г брома и доводят ледяной уксусной кислотой до 1 л. Хранят в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой. Раствор готовится лаборантом (в вытяжном шкафу!); в) иодистый калий, 20%-ный раствор. Готовится непосредственно перед определением; г) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,1 н раствор; д) крахмал, 1%-ный раствор; е) хлороформ.

В сухую коническую колбу или склянку с притертой пробкой емкостью 250-300 мл отвешивают на аналитических весах 0,2-0,3 г масла и растворяют его в 10 мл хлороформа. В другую такую же колбу или склянку вносят 10 мл хлороформа без масла («слепой опыт»), В обе колбы из бюретки (со стеклянным краном) добавляют по 25 мл реактива Гануса. Сосуды плотно закрывают пробками, смоченными в растворе иодистого калия. Содержимое сосудов осторожно взбалтывают, после чего сосуды ставят в темное место на 1-1,5 ч. По истечении указанного времени в оба сосуда добавляют по 10 мл 20%-ного раствора иодистого калия и 50 мл воды и выделившийся иод оттитровывают 0,1 н раствором тиосульфата натрия до слабо-желтой окраски, потом добавляют 10—12 капель раствора крахмала и продолжают титрование до полного обесцвечивания раствора.

При расчетах принимают во внимание, что 1 мл 0,1 н раствора тиосульфата натрия соответствует 1 мл 0,1 н раствора иода. Йодное число и. ч. вычисляют по формуле

где с — количество 0,1 н раствора тиосульфата, израсходованное на титрование контрольной пробы («слепой опыт»), — количество 0,1 н раствора тиосульфата,

израсходованное при титровании опытного образца, к — поправочный коэффициент к титру приблизительно 0,1 н раствора тиосульфата; 0,01269 — титр раствора тиосульфата по иоду; н — навеска масла, г.

Перекисное число.

Общие сведения. Непредельные жирные кислоты легко подвержены окислению. Этот процесс протекает под воздействием кислорода воздуха, влаги, света и катализируется ферментом липоксигеназой (липооксидазой).

Перекиси — неустойчивые соединения. Они легко распадаются с образованием окисей и освобождением атомарного кислорода. Атомарный кислород в свою очередь служит источником образования озона и перекиси водорода.

В дальнейшем перекиси и окиси превращаются в оксикислоты.

Выделившийся озон окисляет новые молекулы непредельных кислот. Образуются нестойкие соединения, озониды, которые гидролитически расщепляются, превращаясь в альдегиды.

Вот почему определение содержания перекисей и альдегидов может оказать большую помощь при суждении о качестве растительного масла.

Определение перекисного числа. Количественное определение перекисей в растительном масле основано на реакции выделения иода перекисями из иодистого калия в кислой среде

Иод оттитровывают раствором тиосульфата.

Реактивы: а) растительное масло (лучше прогорклое); б) уксусная кислота, ледяная; в) хлороформ, химический чистый (лучше — для наркоза); г) калий иодистый, насыщенный раствор. Готовится перед употреблением; д) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,002 н раствор. Готовят перед употреблением из 0,1 н раствора: в мерную колбу на 250 мл с помощью пипетки вносят 5 мл 0,1 н раствора и

доводят до метки прокипяченной (и затем охлажденной до 20° С) дистиллированной водой; е) крахмал, 0,5%-ный раствор.

В конической колбе или склянке с притертой пробкой емкостью 200 мл отвешивают (на аналитических весах) около 2 г масла. Навеску растворяют в 20 мл смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа (2:1 по объему), прибавляют 5 мл насыщенного раствора иодистого калия, сосуд укупоривают пробкой и ставят в темное место на 10 мин., после чего доливают 50 мл дистиллированной воды и оттитровывают выделившийся иод 0,002 н раствором тиосульфата (индикатор — крахмал). Одновременно проводят также контрольное определение (без масла).

Перекисное число п. ч. (количество граммов иода, выделенное перекисями, содержащимися в 100 г масла) рассчитывают по формуле

где с — количество 0,002 н раствора тиосульфата, израсходованное при контрольном определении, — количество 0,002 н раствора тиосульфата, израсходованное при титровании опытного образца, мл; k — поправочный коэффициент раствора тиосульфата; 0,0002538 — титр 0,002 н раствора тиосульфата по иоду (1 мл раствора соответствует 0,0002538 г иода); н — навеска масла, г.

Качественная реакция на альдегиды (с реактивом Шиффа).

Одной из наиболее специфичных является реакция альдегидов с фуксинсернистой кислотой (реактивом Шиффа). Бесцветный раствор фуксинсернистой кислоты под влиянием альдегидов принимает красно-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.

Реакция протекает по следующей схеме:

Реактивы. Реактив Шиффа; можно готовить двумя способами: а) 0,5 г фуксина растворяют в 500 мл воды и фильтруют. 500 мл воды насыщают сернистым ангидридом. Оба раствора сливают вместе и оставляют на 10-12 ч. Хранят в темном месте; б) в мерную колбу емкостью 250 мл вливают 30 мл 0,1%-ного спиртового раствора фуксина, добавляют 15 мл 32%-ного водного раствора сернистокислого натрия воды. Содержимое колбы осторожно перемешивают и оставляют на 1 ч, после чего прибавляют 16 мл разведенной серной кислоты (1:3) и доливают до метки 50%-ным этиловым спиртом. Хранят в склянке темного стекла или темном месте. При исследовании масел предпочтительнее пользоваться реактивом, приготовленным по второму способу.

В пробирку наливают 5-6 мл масла, добавляют 2-3 мл реактива Шиффа и взбалтывают. В случае наличия альдегидов жидкость окрасится в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Максимум окрашивания развивается через 15—16 мин. Если окраска не появляется через 20 мин. после начала опыта, то это свидетельствует об отсутствии альдегидов в масле.

Разделение и идентификация высших предельных жирных кислот с помощью хроматографии на бумаге.

Общие сведения. С помощью описываемого метода

можно разделить и идентифицировать высшие предельные (насыщенные) жирные кислоты, в состав которых входит от 12 до 24 атомов углерода.

Общая методика разделения органических веществ на бумаге описана выше (см. «Распределительная хроматография аминокислот на бумаге»).

Для хроматографирования жирных кислот применяют специально подготовленную гидрофобную бумагу. Высшие жирные кислоты являются гидрофобными веществами, поэтому при хроматографировании исключается применение воды в качестве неподвижной фазы. Роль подвижной фазы обычно выполняет ледяная уксусная кислота или смесь уксусной кислоты с муравьиной и водой (30: 10: 1).

Реактивы и материалы: а) животный жир; б) хроматографическая бумага «быстрая» Ленинградской бумажной фабрики или ватман уксусная кислота, ледяная, или смесь 98%-ной уксусной кислоты, 85%-ной муравьиной и воды в соотношении (по объему); г) вазелиновое масло (-ный раствор в бензоле) или керосин (температура кипения ); д) основной азотнокислый висмут, насыщенный раствор: 1 г соли тщательно взбалтывают с 1 л дистиллированной воды в течение 5—8 мин. Используют мутноватый раствор; е) раствор сульфгидрата аммония: раствор аммиака насыщают сероводородом или готовят -ный раствор сернистого натрия в растворе аммиака указанной, плотности; ж) соляная кислота, раствор; з) серная кислота по объему); и) кали едкое, 25%-ный спиртовой раствор. Можно использовать 0,5 н раствор, применяемый при определении числа омыления жира; к) толуол, хлороформ, ацетон, метиловый или этиловый спирт, диэтиловый эфир; метчики: пальмитиновая, стеариновая и другие высшие предельные жирные кислоты.

Подготовка хроматографической бумаги. Бумагу промывают 0,5%-ным раствором соляной кислоты в течение 3 мин., после чего 5—6 раз дистиллированной водой, 3 раза этиловым спиртом и 4—5 раз диэтиловым эфиром, затем высушивают на воздухе (работу проводят под тягой, при выключенных нагревательных приборах, соблюдая при этом противопожарные мероприятия).

Промытую и высушенную бумагу разрезают на полоски шириной 1—2 см и длиной 30—35 см. Один край каждой полоски прокалывают иголкой с ниткой, образуя петлю. Для гидрофобизации полоски опускают в цилиндр с притертой пробкой, на дно которого (слоем высотой в 4—6 см) налит бензольный раствор вазелинового масла. Нитяные петли подводят под пробку и сосуд плотно укупоривают. Полоски вынимают, когда раствор дойдет до верхнего края бумаги (на 1 см до петли), и высушивают при комнатной температуре (в вытяжном шкафу). При обработке керосином полоски погружают в жидкость на 1 мин., потом вынимают, отжимают роликом между двумя листами фильтровальной бумаги и высушивают в висячем положении при комнатной температуре (в вытяжном шкафу).

Выделение смеси жирных кислот. В коническую колбу вносят 2—3 г жира и добавляют 20— 25 мл 25%-ного спиртового раствора едкого кали. Колбу плотно закрывают пробкой с обратным холодильником, ставят на кипящую водяную баню и проводят омыление жира в течение 35—40 мин. К раствору мыла в колбе прибавляют 25-30 мл горячей воды и перемешивают. Раствор переливают в выпарительную чашку и нагревают на горячей водяной бане (температура воды не выше 85° С) до полного исчезновения запаха спирта. К жидкости в чашке добавляют несколько миллилитров раствора серной кислоты (1:3) до полного выделения слоя жирных кислот. Содержимое чашки осторожно переливают в делительную воронку. Отделяют водно-кислотный слой, а слой жирных кислот несколько раз промывают теплой водой до нейтральной реакции промывных вод по метилоранжу. Промытый слой жирных кислот фильтруют через сухую фильтровальную бумагу в темную склянку с притертой пробкой и хранят в холодильнике.

Для хроматографирования готовят раствор жирных кислот в толуоле или ацетоне, или метиловом спирте, или смеси этилового спирта с диэтиловым эфиром. Отдельно готовят раствор метчиков (в том же растворителе). Концентрацию кислот в растворах подбирают так, чтобы в капле, нанесенной микропипеткой на бумагу, содержалось 10—25 мкг каждой кислоты.

Хроматографирование. На расстоянии 1—1,5 см от нижнего края бумажной полоски графитовым

карандашом вычерчивают прямую линию, на которую с помощью микропипетки наносят каплю испытуемого раствора. На другую такую же полоску наносят каплю раствора метчиков. Капли высушивают на воздухе.

Разделение производят в стеклянных цилиндрах с притертыми пробками при комнатной температуре. На дно цилиндра наливают ледяную уксусную кислоту или смесь уксусной кислоты, муравьиной кислоты и воды . Полоску подвешивают за нитяную петлю, которую подводят под пробку так, чтобы нижний край бумаги был погружен в жидкость на 3—5 мм.

Рис. 12. Хроматограмма жирных кислот.

После того как растворитель поднялся по бумаге на 26—28 см, полоски вынимают и высушивают при комнатной температуре, затем промывают в дистиллированной воде и снова высушивают.

В фотографическую ванночку наливают раствор основного азотнокислого висмута, в который кладут хроматограммы на 10—15 мин., затем их перекладывают в другую ванночку с дистиллированной водой, которую меняют 10—12 раз. Хорошо промытые полоски опрыскивают раствором сульфгидрата аммония (или кладут в ванночку с раствором): появляются черные пятна жирных кислот (рис. 12). Хроматограммы 5—6 раз промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Рассчитывают каждой кислоты

на опытной и контрольной хроматограммах (с метчиками) и по совпадению их мест устанавливают состав кислот испытуемого жира.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление