Главная > Химия > Практикум по биологической химии
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

ВИТАМИН С (АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА)

Общие сведения.

Антицинготный витамин С —аскорбиновая кислота — по химическому составу является лактоном 2,3-диенол-гулоновой кислоты. Аскорбиновая кислота— окисленное производное шестиатомного спирта сорбита — характерна наличием диенольной группы которая обусловливает способность витамина С легко подвергаться окислению с одновременным восстановлением других соединений.

Витаминной активностью обладает лишь -аскорбиновая кислота; Д-аскорбиновая кислота физиологически инертна.

-аскорбиновая кислота — бесцветные кристаллы, легко растворимые в воде, сильно кислого вкуса. Нерастворима в бензоле, хлороформе, диэтиловом эфире, жирах. Водные растворы аскорбиновой кислоты имеют кислую реакцию. Аскорбиновая кислота легко окисляется, образуя дегидроаскорбиновую кислоту, сохраняющую витаминную ценность:

аскорбиновая кислота новая кис/юта.

Дегидроаскорбиновая кислота — соединение весьма неустойчивое и при восстановлении снова переходит в -аскорбиновую кислоту. Это свойство витамина С определяет его активное участие в окислительно-восстановительных процессах. Аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты активные компоненты процессов переноса электронов. При pH 7 (и выше) дегидроаскорбиновая кислота необратимо окисляется в L-дикетогулоновую кислоту, которая уже не обладает свойствами витамина С. Витамин С принимает участие во многих ферментативных реакциях, являясь активатором или ингибитором ряда энзиматических систем.

Окисление аскорбиновой кислоты легко происходит в нейтральной и щелочной среде, оно катализируется ионами тяжелых металлов (меди, железа, серебра). Глюкоза, глютаминовая кислота, флавоноиды, креатинин, тиомочевина стабилизируют аскорбиновую кислоту в растворах. Аскорбиновая кислота обладает сильными восстанавливающими свойствами: соли окислов металлов восстанавливаются ею в соли закиси, а в щелочной среде — соли меди, ртути, серебра, золота — до металлов. Нитраты восстанавливаются в нитриты, арсенаты — в арсениты, метиленовая синь и 2,6-дихлорфенолиндофенол — в бесцветные соединения (лейкоформы). В кислой среде восстанавливающие свойства аскорбиновой кислоты выражены значительно слабее.

Следует подчеркнуть, что кислоты стабилизируют аскорбиновую кислоту в растворах.

Суточная потребность человека в витамине С зависит от возраста, физиологического состояния и тяжести выполняемой работы и составляет 70—120 мг для взрослых и 30—70 мг для детей.

Исследование восстанавливающих свойств аскорбиновой кислоты.

Легко вступая в окислительно-восстановительные реакции, аскорбиновая кислота восстанавливает метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, железосинеродистый калий, азотнокислое серебро и другие вещества. Это свойство положено в основу качественных реакций на витамин С.

Реакция с метиленовой синью. Аскорбиновая кислота на свету восстанавливает метиленовую синь в бесцветное соединение (лейкоформу), окисляясь в дегидроаскорбиновую кислоту

Реактивы: а) сок картофеля или капусты. Клубень картофеля или часть кочана капусты натирают на терке из нержавеющей стали. Растертую массу отжимают через марлю, сложенную в два слоя; б) метиленовая синь, 0,01%-ный раствор; в) натрий углекислый, 5%-ныы раствор.

К 1 мл свежсотжатого сока картофеля или капусты добавляют 1—2 капли раствора метиленовой сини и 2 - 3 капли раствора соды. Пробирку слегка подогревают. Наблюдают обесцвечивание синей окраски.

Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. Аскорбиновая кислота окисляется 2,6-дихлорфено-линдофенолом в дегидроаскорбиновую кислоту, а сам реактив

восстанавливается при этом в бесцветное соединение (лейкоформу):

Реактивы: а) сок капусты или картофеля (приготовление — см. предыдущую работу); б) 2,6-дихлорфенолиндофенол, натриевая соль, 0,001 н раствор (см. «Количественное определение витамина С в растительном сырье»); в) соляная кислота, 2%-ный раствор.

В пробирку наливают 1 мл сока капусты или картофеля, прибавляют 3—4 капли 2%-ного раствора соляной кислоты и по каплям раствор 2,6-дихлорфенолиндофено-ла. Реактив будет обесцвечиваться до тех пор, пока вся аскорбиновая кислота не окислится в дегидроаскорбиновую, после чего первая же капля раствора окрасит жидкость в розовый цвет, так как 2,6-дихлорфенолиндофенол уже не восстанавливается.

Реакция с железосинеродистым калием. Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает

железосинеродистый калий до железистосинеродистого который с ионом трехвалентного железа образует в кислой среде берлинскую лазурь

Реактивы: а) сок капусты или картофеля (см. выше); б) железосинеродистый калий, 5%-ный раствор; в) едкое кали, 5%-ный раствор; г) соляная кислота, 10%-ный раствор; д) хлорное железо, 1%-ный раствор.

К 1 мл сока капусты или картофеля прибавляют 2 капли раствора едкого кали, столько же раствора железосинеродистого калия и встряхивают пробирку, после чего добавляют 6—8 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 1—2 капли раствора хлорного железа. Выпадает синий или зеленовато-синий осадок берлинской лазури.

Количественное определение витамина С в растительном сырье

(но методике Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства). Определение содержания

витамина С основано на способности аскорбиновой кислоты к окислению в дегидроаскорбиновую. 2,6-Дихлорфенолиндофенол, окисляя аскорбиновую кислоту, восстанавливается в бесцветное соединение (лейко-форму). (Уравнение реакции см. в работе «Исследование восстанавливающих свойств аскорбиновой кислоты».)

Раствор натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндофенола (реактив Тильманса) в нейтральной и щелочной среде обладает синей окраской, в кислой среде принимает розовое окрашивание.

Реактивы: а) соляная кислота, 1%-ный раствор;

б) щавелевая кислота, 1%-ный раствор; в) серная кислота, 2%-ный раствор; г) аскорбиновая кислота, кристаллическая; д) иодистый калий кристаллический. Пожелтевший препарат непригоден; е) крахмал растворимый, 1%-ный раствор; ж) йодноеатокислый калий н раствор. Химически чистую соль высушивают 2 ч при 100—102°. Навеску 3,568 г высушенной соли растворяют в мерной колбе емкостью 1 л. Из полученного децинормального раствора готовят миллинормальный: 10 мл раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 1 л и доводят водой до метки. 0,001 н раствор готовят по мере надобности; з) 2,6-дихлорфенолиндофенол, натриевая соль (краска Тильманса), 0,001 н раствор. 60—65 мг сухой краски (навеска на технических весах) переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, добавляют 100-125 мл дистиллированной воды и 4—5 капель 0,01 н раствора едкого натра, взбалтывают в течение 10— 15 мин. и оставляют на 6-8 ч (можно на ночь), после чего раствор доводят водой до метки и фильтруют через бумагу в склянку из темного стекла. Хранят в темном и прохладном месте (лучше всего — в холодильнике). Раствор годен 6—7 дней, титр его проверяют ежедневно.

Аппаратура и посуда: а) микробюретки емкостью 1 и 5 мл; б) пипетки Мора емкостью 5 и 10 мл;

в) мерные колбы емкостью 100, 200 и 1000 мл; г) конические колбы емкостью 50-100 мл; д) фарфоровые чашки; е) ступка фарфоровая с пестиком; ж) ножи из нержавеющей стали или хромированные; з) воронки; и) весы техно химические на 200 г.

Установка титра раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте

(по С. М. Прокошеву). В 50 мл 2%-ного раствора серной кислоты растворяют несколько кристаллов аскорбиновой кислоты (примерно 1-1,5 мг, взвешивать не надо). 5 мл раствора титруют из микробюретки приготовленным (приблизительно 0,001 н) раствором 2,6-дихлор-фенолиндофенола до появления розового окрашивания. Снова берут той же пипеткой в другую колбочку 5 мл раствора аскорбиновой кислоты, добавляют несколько кристалликов йодистого калия (KJ), 2—3 капли 1%-ного раствора крахмала и титруют 0,001 н раствором иодноватокислого калия () до появления голубого окрашивания.

Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола вычисляют (при расчетах принимают во внимание, что 1 мл 0,001 н раствора эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты) по формуле

где А — количество миллилитров 0,001 н раствора иодноватокислого калия, израсходованное на титрование раствора аскорбиновой кислоты; В — количество миллилитров раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшее на титрование.

Таким образом узнают, скольким миллиграммам аскорбиновой кислоты соответствует 1 мл приготовленного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола проверяют перед самым определением содержания витамина С в растительном материале.

Подготовка материала к исследованию. При исследовании картофеля из каждого клубня вырезают сектор наподобие лимонной дольки, чтобы захватить все слои клубня. При анализе кочанной капусты срез делают через все слои кочана. Томаты и другие сочные плоды разрезают по вертикальной оси на 4—6 частей и для исследования берут одну часть.

Пробы, взятые из нескольких клубней, кочанов, плодов, составляют среднюю пробу.

Среднюю пробу плодов, овощей, листьев быстро разрезают ножом из нержавеющей стали или хромированным (на стеклянной пластинке или в фарфоровой чашке).

Мелкие плоды и ягоды растирают в ступке. При исследовании вишен, черешен, слив удаляют косточки. Листья разрезают на кусочки. Из измельченного (разрезанного или растертого) и тщательно перемешанного материала берут две параллельные навески на технических весах в стаканчики или на часовые стекла. В навесках определяют содержание аскорбиновой кислоты.

В зависимости от предполагаемого содержания витамина С навески должны составлять г.

Ход анализа. Навеску в ступке сразу же заливают 20 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и быстро растирают до образования однородной кашицеобразной массы. Для облегчения процесса растирания можно добавить немного хорошо промытого и высушенного стеклянного порошка.

Растертую гомогенную массу при помощи воронки и стеклянной палочки переводят в мерную колбу на 100 мл. Ступку и пестик несколько раз ополаскивают 1%-ным раствором щавелевой кислоты, который вливают в ту же мерную колбу. Содержимое колбы доводят до метки той же 1%-ной щавелевой кислотой. Колбу закрывают пробкой, тщательно взбалтывают в течение 1—2 мин. и оставляют на 8—10 мин., после чего ее содержимое фильтруют через сухой бумажный фильтр или центрифугируют.

Смесь соляной и щавелевой кислот не только извлекает из тканей аскорбиновую кислоту, но и повышает ее устойчивость в вытяжке.

В 2—3 конические колбы на 50—100 мл пипеткой вносят по 10 мл фильтрата, который титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, удерживающейся в течение 0,5-1 мин. Параллельно проводят не менее двух-трех титрований.

Одновременно проводят контрольный опыт для проверки восстанавливающих свойств растворов соляной и щавелевой кислот, которые применялись для извлечения витамина С. В мерную колбу на 100 мл вносят 20 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и доводят до метки -ным раствором щавелевой кислоты. Содержимое колбы перемешивают и пипеткой берут для титрования две пробы по 10 мл, которые титруют тем же раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания.

Полученную поправку (так называемую поправку на реактивы) вычитают из результатов титрования опытного раствора. Величина ее обычно составляет 0,05-0,1 мл.

Содержание витамина С (в миллиграммах на 100 г растительного материала) рассчитывают по формуле

где А — количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофено-ла, израсходованное на титрование опытного раствора (среднее из 2—3 титрований), а — количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное в контрольном опыте (поправка на реактивы), ; Т — титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, мг; В — общий объем вытяжки (100 мл); н — навеска растительного материала, г; — количество фильтрата, взятое для титрования,

Определение витамина С в окрашенных объектах.

Титрование раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола вытяжек из окрашенных плодов и овощей (например, вишен, черной смородины, свеклы и т. д.) связано со значительными трудностями, так как зачастую невозможно проследить за изменением окраски экстракта и определить конец титрования.

Вытяжки из окрашенных плодов и овощей рекомендуется титровать в присутствии хлороформа или дихлорэтана. Метод неприменим в случае наличия в сырье хлорофилла, ксантофиллов и других зеленых и желтых пигментов.

Экстрагирование витамина С из растительного материала производят, как было указано в предыдущей работе.

В 2—3 большие пробирки (длина 150 мм, диаметр 20—25 мм) пипеткой вносят по 5-10 мл окрашенной вытяжки, добавляют по 5-6 мл чистого хлороформа или дихлорэтана, после чего титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, перемешивая жидкость стеклянной палочкой с загнутым концом. Титрование заканчивают при появлении розового окрашивания слоя органического растворителя.

Параллельно проводят контрольный опыт, титруя раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола смесь 1%-ных растворов соляной и щавелевой кислот (1 : 4).

Содержание витамина С рассчитывают по формуле, приведенной в предыдущей работе.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление