Главная > Химия > Аналитическая физиология клеток и развивающихся организмов
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

Контроль синтеза рибосомной РНК

Как видно из рис. 2.1, рост бактерий при ферментативной адаптации прерывается в экспоненциальной фазе, а затем возобновляется на новом источнике углерода (лактозе) со скоростью, почти равной скорости на глюкозе. Механизм роста клетки во время этой адаптации в основном остается интактным, а изменения происходят только в тех физиологических процессах, которые непосредственно связаны с катаболизмом лактозы. Посмотрим теперь, что произойдет, если клетки перенести из среды, которая обеспечивает только относительно медленный рост (скажем, минимальная солевая среда с глюкозой, время удвоения около 60 мин), в питательную среду, которая позволяет клеткам делиться каждые 20 мин. Какие факторы будут определять изменение общей скорости роста?

Подробное исследование этой проблемы — проблемы регуляции синтеза макромолекул типа ДНК, РНК и белка — было предпринято О. Малё и его коллегами в Копенгагене на бактериях Е. coli и Salmonella typhimurium. Большинство полученных ими результатов изложено в книге Малё в Кьельдегаарда «Управление синтезом макромолекул» (Maalфе, Kjeldegaard,

1966). Ряд важных данных содержит и более ранняя работа Малё и Курланда (Maale, Kurland, 1963). Они обнаружили, что во время перехода с относительно бедной среды на богатую

(сдвиг вверх) белки, РНК и ДНК ведут себя по-разному. Первой на изменение условий реагирует РНК, концентрация которой в клетках быстро возрастает и примерно через 15 мин после смены среды устанавливается на уровне, соответствующем новой скорости роста. Только тогда устанавливается на новом уровне скорость синтеза белка и, наконец, сразу за белком возрастает до нового значения скорость синтеза ДНК. Конечно, как только достигнуто новое стационарное состояние роста бактерий, все три концентрации должны возрастать с одной и той же скоростью. Но тот факт, что РНК реагирует первой, говорит нам о двух вещах: во-первых, эти виды макромолекул, по-видимому, отделены друг от друга динамически настолько, что они имеют разные цепи управления, и, во-вторых, РНК играет решающую роль в определении общей скорости клеточного роста. Поскольку основная часть этой РНК рибосомная, а транспортной РНК (тРНК) и информационной (матричной) РНК (мРНК) в клетке гораздо меньше, то в этом случае речь идет о системе управления генами рибосомной РНК. Мы уже видели, как синтез мРНК контролируется механизмами репрессии.

Подтверждение того, что фактором, лимитирующим скорость роста, является рибосомная РНК (рРНК), было получено Малё и Курландом, показавшими, что отношение скорости синтеза белка к концентрации рРНК в клетке постоянно в широком диапазоне скоростей роста. Это соотношение может быть записано в виде , где — количество белка, синтезированного в единицу времени, — внутриклеточная концентрация рРНК. Из этого соотношения следует, что, чем быстрее растут клетки, тем больше должна быть плотность рибосом в цитоплазме, — факт, действительно имеющий место. Клетка, растущая в питательной среде со временем удвоения 20 мин, вся заполнена рибосомами, за исключением ядерных областей, где локализованы хромосомы и рибосомы встречаются редко. Это обычно большие клетки, имеющие в среднем 3,1 ядра. Клетки, растущие со временем удвоения 40 мин, примерно вдвое меньше, содержат — 1,5 ядра на клетку и обладают почти вдвое меньшей плотностью рибосом, а клетки со временем удвоения 120 мин, совсем маленькие, с немногочисленной популяцией рибосом в цитоплазме, содержат около 1,2 ядра на клетку. Ниже мы рассмотрим, почему клетки меняют свои размеры при разных скоростях роста.

В поисках возможного механизма управления, который объяснял бы тот факт, что во время переходного процесса синтез рибосомной РНК на некоторое время может быть разобщен с синтезом белка и ДНК, а при сбалансированном росте между этими системами существуют вполне определенные соотношения,

Малё и Курланд (Maalфе, Kurland, 1963) использовали два важных результата. Первый факт состоял в том, что клетки, которым не достает одной из 20 аминокислот, не синтезируют заметного количества рРНК, хотя синтез рРНК начинается тут же, если их обеспечить требуемой аминокислотой, даже в случае, когда белковый синтез подавлен хлорамфениколом. Второй факт был следующим: если к нормальным клеткам, растущим на минимальной глюкозо-солевой среде (т. е. без аминокислот), добавить хлорамфеникол, то произойдет заметное увеличение скорости синтеза рРНК, подобное тому, которое имеет место при замене бедной среды на богатую, а затем скорость упадет до низкого значения. В целом рост такой культуры, блокированной хлорамфениколом, конечно, останавливается. Оба эти факта указывают на то, что элементами звена управления, связывающего условия роста и скорость синтеза рРНК, являются, по-видимому, аминокислоты, так как хлорамфеникол блокирует белковый синтез, препятствуя переносу аминокислот на рибосому комплексом аминоацил-тРНК.

Следуя логике модели репрессии по типу обратной связи, нам следует искать некий метаболит, который являлся бы продуктом белкового синтеза и действовал как кофактор при репрессии синтеза рибосомной РНК- Таким метаболитом может быть незаряженная тРНК, т. е. тРНК, свободная от аминокислоты. Клетки, которым не достает одной из 20 аминокислот, имели бы популяцию таких тРНК, соответствующих отсутствующей аминокислоте, и эти молекулы действовали бы как коре-прессоры, активируя репрессор так же, как это делает аргинин при репрессии аргининовых структурных генов. Очевидно, было бы необходимо, чтобы эту роль могла играть любая из 20 разновидностей тРНК, и это требование не кажется неправдоподобным. Вполне допустимо, что у всех тРНК существует нуклеотидная последовательность длиной от 70 до 80 нуклеотидов с мол. весом около 25 000, которая специфически взаимодействует с белковым апорепрессором, давая активный репрессор. В этом случае действие хлорамфеникола легко объясняется накоплением аминокислот в клетках, в которых нет белкового синтеза, что приводит к превращению тРНК в аминоацильную форму и дерепрессии генов рРНК. Степень этой дерепрессии должна зависеть от внутриклеточной концентрации аминокислот в момент начала блокирования хлорамфениколом: если содержание аминокислот в клетке высоко, препарат вызовет небольшое изменение в концентрации аминокислот и поэтому не приведет к заметному изменению в синтезе рРНК, но если уровень аминокислоты в клетке низок, то эффект будет значительным. Это соответствует данным, полученным на культурах, растущих на богатых, средних и бедных средах.

Исходя из наших представлений о цепях репрессии по типу обратной связи, можно ожидать, что должен существовать соответствующий конститутивный мутант; в данном случае это мутант, характеризующийся относительно высокой скоростью синтеза рРНК независимо от условий питания и, следовательно, внутриклеточной концентрации аминокислот. Такой мутант, названный «релаксированным» и обозначенный RC, был обнаружен Стентом и Бреннером (Stent, Brenner, 1961). Ген бактерии дикого типа, имеет рассмотренное выше строгое управление синтезом рРНК, которое срабатывает в ответ на изменения содержания аминокислот.

Рис. 2.5. Схема цепи управления синтезом рРНК, согласно представлениям Малё и Курланда (Maaloe, Kurland, 1963).

Согласно этим данным, управляющая схема может выглядеть так, как это показано на рис. 2.5. На этом весьма схематичном рисунке — гены, ответственные за синтез рРНК, а рРНК — функционирующие рибосомы, которые производят белок и тРНК из аминоацил-тРНК. Любая из тРНК. может функционировать как корепрессор апорепрессора Р, продукта активности гена RC. Эта управляющая цепь работает по тем же принципам, что и сеть, представленная на рис. 2.4, и в действительности была сконструирована на основе репрессии по типу обратной связи. К сожалению, несмотря на все свое изящество и кажущееся правдоподобие, она не может объяснить полученные позже данные и нуждается в доработке. Представления о молекулярной основе регуляции синтеза рРНК, развивались аналогично теории управления при катаболитной репрессии, поскольку до того, как выяснилось, какую роль в «эффекте глюкозы» играет цАМФ, для этой ситуации предлагалась цепь управления, основанная на принципах репрессии по типу обратной связи, несколько более простая, чем изображенная на рис. 2.3. Доказательством более сложной природы регуляции явилось обнаружение Лумисом и Магазаником (Loomis, Maga-sanik, 1966) в 1966 г. мутанта конститутивного типа, который, подобно мутанту характеризуется релаксированным поведением

состоящим в том, что он не реагирует на глюкозу обычным способом и производит р-галактозидазу в присутствии индуктора (необходимое условие) независимо от наличия глюкозы. Поэтому предположили, что этот мутант, обозначенный CR- (дефектный в отношении катаболитной репрессии), синтезирует дефектный апорепрессорный белок, который в норме объединялся бы с катаболитным репрессором (рис. 2.3) и останавливал транскрипцию с lac-оперона. Эта гипотеза в дальнейшем не подтвердилась. Полная картина катаболитной репрессии далеко не ясна. На основании современных данных предлагается механизм, напоминающий изображенный на рис. 2.3, но несколько более сложный; предполагается, что цАМФ, помимо lac-генов, влияет на многие другие гены, вовлеченные в ката-болические процессы. Конститутивное поведение, аналогичное обнаруженному Лумисом и Магазаником, могло бы возникнуть у мутанта, у которого не отвечает на катаболитный репрессор. Вырисовывающаяся при этом картина, которая рассматривает управление рРНК посредством специфических и в некоторой степени неожиданных метаболитов, довольно близка к той, которая характерна для управления lac-опероном; одним из элементов этой системы вполне может оказаться регуляция более высокого уровня интеграции, осуществляемая с помощью вновь открытого метаболита.

Один важный факт, заставляющий усомниться в адекватности схемы управления, изображенной на рис. 2.5, — это отсутствие влияния различных аминокислотных условий и различных мутаций на РНК-полимеразную активность. Другой возможный механизм действия RC-гена мог бы состоять в управлении предшественниками синтеза РНК; такое управление действовало бы на синтез всех РНК — мРНК, тРНК, а также и рРНК. В работе Кэшела и Гэллента (Cashel, Gallant, 1969) было высказано мнение, что когда тРНК того или иного типа не нагружается соответствующей ей аминокислотой, какая-то реакция, обычно участвующая в белковом синтезе, работает вхолостую и что в ходе этой «холостой» реакции, в которой участвует продукт -гена, образуется ингибитор реакции фосфорилирования, производящей предшественники синтеза РНК. С помощью авторадиографии и хроматографического разделения соединений они показали, что в клетках дикого типа, лишенных аминокислот, метаболит действительно накапливается, а в клетках — нет. Этот метаболит оказался фосфорилированным соединением неизвестной природы и получил название магического пятна (MS); обозначают его MSI. Позже было показано, что это гуанозинте-трафосфат, Одновременно было обнаружено второе фос-форилированное вещество, обозначенное Оно, по-видимому, является нетоксичной формой

Открытие ффГфф и его роли в регуляции синтеза РНК стимулировало довольно интенсивное изучение возможного управляющего контура этой системы. Из работ ряда исследователей (Pederson, Lane, Kalgora, 1973; Hazeltine et al., 1973; Yang et al., 1974) возникает некая общая, довольно неясная в деталях картина. Продуктом -гена является белок с мол. весом около 80 000 который назван ограничивающим фактором (stringent factor, SF).

Рис. 2.6. Возможная цепь управления синтезом рРНК с участием

Когда его добавляют в реакционную систему, содержащую рибосомы, ГДФ и АТФ, синтезируется гуанозинтетрафосфат. Возможно, SF сам является участником нормального процесса трансляции, но в отсутствие аминокислоты система производит Этот тетрафосфат—сильный ингибитор первого фермента в биосинтетических путях образования ГТФ и АТФ, так что в первую очередь его действие сводится к остановке синтеза предшественников, необходимых для синтеза РНК. Кроме того, ффГфф отчасти ингибирует РНК-по-лимеразу и уменьшает время жизни рРНК (Gallant et al., 1972). Таким образом, полная картина управления довольно

близка к той, что изображена на рис. 2.6. Здесь гены любой структурный ген.

В присутствии аминоацил-тРНК происходит трансляция и ффГфф не образуется или образуется в малом количестве. Однако в отсутствие аминокислоты рибосомный реакционный комплекс производит ффГфф, который затем ингибирует производство ГТФ и АТФ, угнетая первые ферменты цепи метаболизма от инозиновой кислоты к пуринтрифосфатам, и ингибирует РНК-полимеразу. Хлорамфеникол, по-видимому, непосредственно ингибирует синтез ффГфф, предотвращая таким образом нормальную ограничивающую реакцию. Хотя релаксированный мутант способен синтезировать белок, он не может производить ффГфф и поэтому не в состоянии нормально реагировать на дефицит аминокислот. Таким образом, мы видим, что довольно простая картина, изображенная на рис. 2.5, существенно усложняется. Вместо петли репрессии по типу обратной связи, специфичной для генов рРНК, мы имеем значительно более общую петлю обратной связи, в образовании которой участвует новый метаболит, ответственный за регулирующую функцию высокого уровня. Таким образом, между скоростями синтеза белка и РНК имеется очень тонко отрегулированная связь, осуществляемая с помощью пулов предшественников этих макромолекул. Мы снова видим, что простого разделения прокариотических клеток на функциональные единицы управления провести не удается; связано это с интегративными эффектами координирующего сигнала. Прототипом единицы управления является путь биосинтеза аргинина, где на репрессию генов, включенных в этот метаболизм, влияет только аргинин, и такой регуляцией затрагиваются только эти гены (Gorini, 1963). Однако репрессия lac-оперона и управление синтезом РНК показали нам, что при регуляции физиологической функции имеют место более сложные взаимодействия и координирование достигается с помощью специальных метаболитов, таких, как цАМФ и ффГфф. Их полезно рассматривать в качестве прокариотических аналогов гормонов.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление